Pengembangan Alat Diagnostik HBsAg Berdasarkan Metode Imunokromatografi

Pendahuluan

Infeksi virus hepatitis B adalah salah satu hepatitis yang tersering ditemukan dan merupakan problem kesehatan masyarakat yang besar di dunia. Pada saat ini diperkirakan terdapat 350 juta pengidap hepatitis B di dunia dan tiga perempat dari mereka (78%) berada di negara Asia Tenggara termasuk Indonesia (WHO, 1987). Di Indonesia hepatitis merupakan penyebab kematian nomor tiga setelah penyakit infeksi dan paru dengan jumlah penderita mencapai ± 40 juta.

Rapid test merupakan uji kromatografi immunoassay dengan menggunakan metode “direct sandwich”.  Prinsip dasar rapid test adalah pengikatan antigen oleh antibodi monoklonal yang spesifik.  Salah satu jenis rapid tes yang banyak digunakan adalah alat diagnostik berupa stik uji untuk mendeteksi keberadaan antigen atau pun antibody dalam sampel berupa darah, plasma atau serum. Stik uji ini mirip dengan stik kehamilan yang menggunakan prinsip imunokromatografi yang telah banyak digunakan dan beredar di masyarakat.

Secara umum metode Imunokromatografi  untuk  mendeteksi sebuah spesimen dengan menggunakan dua antibodi. Antibodi pertama berada  dalam larutan uji atau sebagian terdapat  pada  membran berpori dari alat uji.  Antibodi ini dilabeli dengan lateks partikel atau partikel koloid emas (antibody berlabel). Keberadaan antigen akan dikenali oleh antibody berlabel dengan membentuk ikatan antigen-antibodi . komplek ikatan ini kemudian akan mengalir  karena adanya  kapilaritas menuju penyerap, yang terbuat dari kertas penyaring. Selama aliran, kompleks ini akan dideteksi dan diikat oleh antibody kedua  yang terdapat pada  membran berpori, sehingga terdapat komplek pada daerah deteksi pada membran yang menunjukkan hasil uji.

Immunochromatography test (ICT) HBsAg  merupakan uji imunokromatografi yang dapat mendeteksi antigen yang terdapat pada serum atau plasma.  Prinsip dasarnya adalah adanya pengikatan antara antigen (HBsAG) dengan antibody (anti-HBs) pada daerah test line, selanjutnya antibody akan berikatan dengan colloidal gold-labeled conjugate.  Komplek yang terbentuk akan bergerak pada membran nitroselulosa.

Deteksi antigen dengan menggunakan metode ini memiliki beberapa kelebihan jika dibandingkan dengan metode yang lain seperti ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), RIA-IRMA dan lain-lain. Kelebihan metode ini adalah waktu yang diperlukan untuk pengujian relatif singkat sekitar 2-10 menit dan hasil uji dapat dilihat secara langsung. Pengujian dengan metode ini juga dapat dilakukan oleh setiap orang karena tidak memerlukan ketrampilan khusus seperti halnya dalam uji ELISA. Selain itu, metode ini dapat dijadikan sebagai pemeriksaan awal (screening test) untuk uji kualitatif dan dapat dikerjakan langsung di lapangan karena merupakan alat uji yang sederhana. Walaupun, metode ini lebih sederhana dan mudah dibandingkan metode lainnya, akan tetapi memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi terhadap antigen.

Riset dan Pengembangan

Penelitian tentang pembuatan alat diagnostik yang praktis berdasarkan metode imunokromatografi terhadap HBsAg telah banyak dilakukan dan dikembangkan. Penelitian ini meliputi penelitian pembuatan antibody monoklonal yang spesifik terhadap HBsAg, uji sensitivitas dan uji spesifisitas. Penelitian ini sangat diperlukan untuk membandingkan strip HBsAg yang dikembangkan dengan alat diagnostic lainnya yang beredar di pasaran. 

Pembuatan antibodi monoklonal

Pembuatan antibodi monoklonal dilakukan berdasarkan teknologi hibridoma dengan menggunakan hewan coba berupa tikus atau kelinci. Langkah-langkah dalam pembuatan antibody monoklonal seperti pada gambar di bawah ini:

Alur pembuatan antibodi monoklonal

1. Antigen disuntikkan pada hewan coba dengan harapan hewan coba membentuk antibodi terhadap antigen yang disuntikkan. Darah dari hewan coba kemudian disentrifugasi untuk memisahkan plasma darah dengan serum. Serum yang didapatkan mengandung antibody terhadap antigen, akan tetapi antibody yang dihasilkan merupakan antibody poliklonal.
2. Sel limfosit dari hewan coba yang telah disuntik antigen kemudian diambil dan difusikan dengan sel myeloma sehingga terbentuklah sel hibridoma. Sel hibridoma ini kemudian diklon sehingga didapatkan antibody monoklonal yang spesifik terhadap antigen.

Uji Sensitivitas dan Uji Spesifisitas

Uji sensitivitas dan uji spesifisitas alat diagnostic sangat penting dilakukan untuk mengetahui kualitas alat diagnostic yang dikembangkan. Uji sensitivitas dilakukan untuk mengetahui tingkat kemampuan suatu alat diagnostic dalam mendeteksi keberadaan suatu senyawa, dalam hal ini HBsAg. Begitu pula halnya dengan uji spesifisitas. Uji ini dilakukan untuk mengetahui tingkat spesifikasi alat diagnostic dalam mendeteksi suatu senyawa (antigen) tertentu.

Tahapan Pengembangan Produksi (Scalling Up)

Prototype strip diagnostik yang telah melalui uji kelayakan akan menjalani pengembangan proses (scalling up). Hal-hal yang harus diperhatikan dalam melakukan scale up adalah faktor-faktor yang berubah secara mekanik maupun fisik dengan adanya scale up yang dapat menurunkan sensitivitas dan spesifisitas produk.

Tahapan Proses Produksi HBsAg strip

Membran nitroselulosa

Membrane nitroselulosa dengan pori-pori 8 μm disemprot membentuk garis dengan antibody monoklonal dengan konsentrasi 0,4 mg/ml menggunakan mesin semprot (garis pertama). Selanjutnya, sejajar dengan garis pertama dibentuk garis kedua dari anti-immunoglobulin kelinci (IgG) dengan konsentrasi 0,2 mg/ml. Membrane kemudian dikeringkan selama 30 menit sebelum direndam ke dalam larutan penyangga selama 1 menit. Setelah perendaman, membrane dikeringkan kembali selama 60 menit pada suhu 37°C.

Matrik konjugat

Lapisan selanjutnya berupa matriks berpori yang disemprot dengan campuran dari antigen dan konjugat (antibodi monoklonal-koloid emas).  Lapisan ini kemudian dikeringkan pada suhu 37°C selama 2 jam.

Perakitan

Matrik berpori digabungkan dengan lembaran yang mengandung membrane nitroselulosa dan pada salah satu ujungnya. Lembaran kemudian dipotong menjadi strip dengan ukuran 5-6 mm.

Referensi

Peng, F., Z. Wang, S. Zhang, R. Wu, S. Hu, Z. Li, X. Wang, dan D. Bi.  2008.  Development of an Immunochromatographic Strip for Rapid Detection of H9 Subtype Avian Influenza Viruses.  Clinical dan Vaccine Immunology : 569-574.

Shyu, Rong-Hwa, Huey-Fen Hsyu, Hwan-Wun Liu and Shiao-Shek Tang. 2002. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin. Toxicon 40: 255-258.

Ward, P.A., J. Adams, D. Faustman, G.F. Gebhart, J.G. Geistfeld, J.W. Imbaratto, N.C. Peterson, F. Quimby, A. Marshak-Rothstein, A.N. Rowan, and M.D. Scharff. 1999. Monoclonal Antibody Production. National Academy Press. Washington DC.

Yu-Huei Lin, Yu-Hue, Yi Wang, A. Loua, Gwo-Jen Day, Yan Qiu, E.C.B. Nadala Jr., Jean-Pierre Allain, and H.H. Lee. 2008. Evaluation of a New Hepatitis B Virus Surface Antigen Rapid Test with Improved Sensitivity. Journal of Clinical Microbiology Vol. 46, No. 10: 3319-3324.